1Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
La PCR amplifica exponencialmente un segmento específico de ADN, mediante ciclos repetidos de tres pasos a temperaturas controladas:
| Paso | Temperatura aproximada | Evento |
|---|---|---|
| Desnaturalización | ~94-96 °C | Separación de las dos cadenas de la doble hélice por ruptura de los puentes de hidrógeno (capítulo I.1) |
| Hibridación (annealing) de cebadores | ~50-65 °C, según el diseño de los cebadores | Dos cebadores (primers) cortos, sintetizados artificialmente y complementarios a las secuencias que flanquean el segmento de interés, se unen a cada una de las dos cadenas molde |
| Extensión | ~72 °C | Una ADN polimerasa termoestable (Taq polimerasa, aislada de una bacteria termófila) extiende cada cebador, sintetizando una nueva cadena complementaria |
Cada ciclo duplica teóricamente la cantidad de la secuencia de interés; tras ~30-35 ciclos, se generan millones de copias a partir de una cantidad inicial mínima de ADN molde —la razón por la cual la PCR permite trabajar con muestras biológicas de cantidad extremadamente limitada—.
¿Por qué la PCR requiere específicamente una ADN polimerasa termoestable, y no cualquier ADN polimerasa? El paso de desnaturalización requiere calentar la muestra a temperaturas cercanas a la ebullición del agua para separar las dos cadenas de ADN — una ADN polimerasa convencional (como la de la mayoría de los organismos, incluida la humana) se desnaturalizaría irreversiblemente a esa temperatura, perdiendo su estructura tridimensional funcional y quedando inactiva tras el primer ciclo. La Taq polimerasa, aislada de la bacteria termófila Thermus aquaticus (que habita naturalmente en aguas termales a temperaturas cercanas al punto de ebullición), evolucionó para mantener su estructura y función catalítica intactas incluso a esas temperaturas extremas — precisamente la propiedad que permite repetir docenas de ciclos de calentamiento y enfriamiento sin necesidad de agregar enzima nueva en cada ciclo.
2Secuenciación de ADN
La secuenciación determina el orden exacto de nucleótidos de un fragmento de ADN. El método clásico (Sanger) utiliza dideoxinucleótidos marcados que, al incorporarse aleatoriamente durante la síntesis de una nueva cadena, terminan la extensión en ese punto (por carecer del grupo 3'-OH necesario para continuar) — generando una población de fragmentos de longitud variable, cada uno terminado en una posición distinta, que al separarse por tamaño y leerse en orden revelan la secuencia completa. Las tecnologías de secuenciación masiva (de "nueva generación"), desarrolladas posteriormente, permiten secuenciar simultáneamente millones de fragmentos, haciendo posible secuenciar un genoma humano completo en un plazo y costo considerablemente menores que los del Proyecto Genoma Humano original (capítulo III.1).
3Polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (RFLP)
Un RFLP es una variación entre individuos en el patrón de fragmentos generados al cortar su ADN con una enzima de restricción particular (capítulo VI.1) — esta variación surge porque las diferencias en la secuencia de ADN entre individuos pueden crear o destruir sitios de reconocimiento para esa enzima, alterando el tamaño de los fragmentos resultantes. Antes del desarrollo de la secuenciación masiva, el análisis de RFLP fue una herramienta central tanto para el análisis de ligamiento (capítulo IV.5, usando el RFLP como marcador genético) como para el diagnóstico molecular indirecto de ciertas enfermedades hereditarias.
4Técnicas de hibridación molecular
Se basan en la capacidad de una sonda de ácido nucleico marcada (de secuencia conocida) para hibridarse específicamente —por complementariedad de bases— con una secuencia complementaria presente en la muestra a analizar, permitiendo detectarla entre un fondo de secuencias no relacionadas. El Southern blot es la técnica clásica de hibridación para detectar una secuencia de ADN específica —el ADN de la muestra se corta con enzimas de restricción, se separa por tamaño mediante electroforesis, se transfiere a una membrana sólida, y se hibrida con una sonda marcada complementaria a la secuencia de interés—.
5Trampas de examen
| Trampa | Por qué confunde | Aclaración |
|---|---|---|
| Pensar que la PCR requiere conocer la secuencia completa del segmento a amplificar | Se "amplifica" un segmento específico | Solo se necesita conocer las secuencias flanqueantes (donde se unen los cebadores) — la secuencia interna del segmento amplificado puede ser completamente desconocida antes de la PCR, y de hecho puede ser exactamente lo que se busca determinar posteriormente mediante secuenciación |
| Confundir RFLP con una mutación patogénica en sí misma | Ambos son "variaciones en la secuencia de ADN" | Un RFLP es, en la mayoría de los casos, una variante neutra sin efecto funcional directo, útil simplemente como marcador genético para rastrear la herencia de una región cromosómica cercana (por ligamiento, capítulo IV.5) — no implica necesariamente enfermedad |
| Creer que la Taq polimerasa proviene de humanos o de bacterias comunes de laboratorio | Es "una enzima más" del kit de PCR | Proviene específicamente de Thermus aquaticus, una bacteria termófila hallada originalmente en fuentes termales — su origen evolutivo en un ambiente de altas temperaturas es precisamente lo que le confiere la termoestabilidad necesaria para sobrevivir los ciclos repetidos de desnaturalización de la PCR |
6Puntos clave
- La PCR amplifica exponencialmente un segmento de ADN mediante ciclos de desnaturalización, hibridación de cebadores y extensión, usando Taq polimerasa termoestable.
- La secuenciación (Sanger o de nueva generación) determina el orden exacto de nucleótidos de un fragmento de ADN.
- Un RFLP es una variación en el patrón de corte por enzimas de restricción entre individuos, útil como marcador genético para ligamiento o diagnóstico indirecto.
- El Southern blot detecta una secuencia de ADN específica mediante hibridación con una sonda complementaria marcada.