1Enzimas de restricción
Las enzimas de restricción (endonucleasas de restricción), de origen bacteriano, reconocen secuencias específicas de ADN de doble cadena —típicamente palindrómicas, de 4 a 8 pares de bases— y cortan la molécula en ese punto exacto, de forma reproducible cada vez que encuentran esa secuencia. Bacterias las utilizan naturalmente como mecanismo de defensa contra ADN extraño (por ejemplo, de bacteriófagos), protegiendo su propio ADN de la digestión mediante metilación de esas mismas secuencias de reconocimiento.
Muchas enzimas de restricción generan cortes escalonados, dejando extremos cohesivos (o "pegajosos") de cadena simple complementarios entre sí — dos fragmentos de ADN cortados por la misma enzima de restricción, incluso si provienen de organismos completamente distintos, pueden reasociarse entre sí por complementariedad de esos extremos cohesivos, y ser unidos permanentemente por la enzima ADN ligasa, generando una molécula de ADN recombinante.
2Vectores de clonado
Un vector es una molécula de ADN capaz de replicarse de forma autónoma dentro de una célula huésped, utilizada como "vehículo" para introducir y propagar un fragmento de ADN de interés. Los plásmidos bacterianos —moléculas de ADN circular extracromosómico, capaces de replicarse independientemente del cromosoma bacteriano principal— son el vector más utilizado para clonar fragmentos de tamaño pequeño a moderado; para insertos de mayor tamaño se utilizan vectores derivados de bacteriófagos, o cromosomas artificiales bacterianos o de levadura, capaces de albergar segmentos de ADN considerablemente más extensos.
Un vector de clonado típico incluye, además del sitio donde se inserta el fragmento de interés: un origen de replicación (para su propagación autónoma dentro de la célula huésped) y un gen marcador de selección (con frecuencia de resistencia a un antibiótico), que permite identificar y seleccionar específicamente a las células que efectivamente incorporaron el vector recombinante, descartando a las que no lo hicieron.
3Pasos generales para construir ADN recombinante
| Paso | Descripción |
|---|---|
| 1. Corte | El ADN fuente (que contiene el gen de interés) y el vector se cortan con la misma enzima de restricción, generando extremos cohesivos compatibles en ambos |
| 2. Ligado | El fragmento de interés y el vector cortado se mezclan y se unen mediante la ADN ligasa, formando la molécula de ADN recombinante circular completa |
| 3. Transformación | El ADN recombinante se introduce en una célula huésped (típicamente bacteriana), que lo incorpora y comienza a replicarlo junto con su propio ciclo de división |
| 4. Selección | Se identifican las células que efectivamente incorporaron el vector recombinante, generalmente mediante el gen marcador de resistencia a antibiótico incluido en el vector |
| 5. Amplificación/clonado | Las células seleccionadas se cultivan y se dividen repetidamente, generando múltiples copias idénticas (clones) del fragmento de ADN de interés, ahora disponible en cantidad suficiente para su estudio o aplicación |
¿Por qué es tan importante que la misma enzima de restricción se use para cortar tanto el ADN fuente como el vector? Los extremos cohesivos generados por una enzima de restricción particular son complementarios solo entre fragmentos cortados por esa misma enzima (o por otra enzima distinta que reconozca una secuencia diferente pero que, por coincidencia, genere extremos cohesivos idénticos) — no es simplemente "cualquier corte" lo que permite la reasociación, sino la complementariedad específica de bases en el extremo cohesivo resultante. Si el vector y el ADN fuente se cortaran con enzimas de restricción distintas que generan extremos incompatibles entre sí, el fragmento de interés simplemente no podría reasociarse ni ser ligado establemente al vector, sin importar cuánto se intentara — esta es la razón técnica concreta detrás de la elección deliberada de enzimas de restricción compatibles en cualquier protocolo de clonado.
4Trampas de examen
| Trampa | Por qué confunde | Aclaración |
|---|---|---|
| Pensar que todas las enzimas de restricción generan extremos cohesivos | Es el tipo de corte más enfatizado por su utilidad práctica en clonado | Algunas enzimas de restricción generan cortes romos (sin extremos de cadena simple sobresaliente), que también pueden ligarse entre sí, aunque con menor eficiencia y sin la especificidad direccional que ofrecen los extremos cohesivos |
| Confundir el rol del origen de replicación con el del gen marcador de selección en un vector | Ambos son componentes esenciales del mismo vector | El origen de replicación permite que el vector se replique autónomamente dentro de la célula huésped; el gen marcador (por ejemplo, de resistencia a antibiótico) permite identificar/seleccionar qué células efectivamente lo incorporaron — funciones distintas y complementarias |
| Creer que el "clonado" en este contexto es lo mismo que la clonación reproductiva de un organismo completo | Ambos usan la palabra "clonado/clonación" | El clonado molecular de este capítulo se refiere a generar múltiples copias idénticas de un fragmento específico de ADN dentro de células huésped en cultivo — un concepto distinto de la clonación reproductiva de un organismo completo (desarrollada, con sus implicancias técnicas y éticas, más adelante en este capítulo o en el capítulo VI.3) |
5Puntos clave
- Las enzimas de restricción cortan el ADN en secuencias específicas, generando fragmentos con extremos cohesivos compatibles entre sí.
- Un vector (plásmido, u otro) porta origen de replicación y gen marcador de selección, permitiendo propagar y seleccionar el ADN recombinante en una célula huésped.
- Los pasos generales del clonado son: corte, ligado, transformación, selección y amplificación.
- Solo fragmentos cortados con enzimas de restricción compatibles pueden ligarse establemente entre sí.